综述牙周炎影响下口腔微生物群落的变化

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牙周炎；致病菌；微生物检测；口腔微生物

提要

牙周炎是一种由多种因素诱导因牙齿支持结构破坏而导致的慢性炎症，其特点主要表现为细菌沉积在牙龈边缘形成炎症浸润，导致附着在牙齿上的结缔组织破坏、牙槽骨吸收和牙齿脱落。牙菌斑中的细菌及其代谢产物是导致牙周炎的始动因子，其发病机理与致病菌、宿主和环境息息相关，因此通过对微生物的检测有利于牙周炎病因的研究和针对性治疗。随着微生物检测技术的发展，微生物检测方法也由传统的培养鉴定技术发展至分子生物技术，这使得研究者从种属水平上全面研究口腔微生物种类及群落构成成为可能。本文将从牙周炎的病因及危险性因素、牙周炎的口腔微生物群落的变化及常用的牙周炎致病菌检测技术三方面进行综述，目的为牙周炎致病菌进一步的研究提供理论基础和借鉴经验。

牙周炎是一种与细菌感染相关的炎症性疾病，占世界总人口数量的11%[1]，口腔微生物和宿主易感是牙周炎发生发展的先决条件，口腔组织中混合定植的细菌是导致牙周炎的主要病原体。此外，遗传因素和环境因素也是导致牙周炎的重要条件，它们可以加快牙周炎的传播和发展。本文将从牙周炎的病因及危险性因素、牙周炎的口腔微生物群落的变化、常用的牙周炎致病菌检测技术等方面进行综述。

一、牙周炎的病因及危险性因素

牙周炎的主要特点表现为细菌沉积在牙龈边缘形成炎症浸润，导致附着在牙齿上的结缔组织破坏、牙槽骨吸收和牙齿脱落。其中牙菌斑在牙龈病变和牙周炎发生中发挥重要作用。牙菌斑是一种复杂的生物膜，是由保护性基质包裹的细菌定植区域。保护性基质由细胞外多糖和糖蛋白组成，为口腔生物膜中的微生物提供安全的生存环境。口腔生物膜的这种成分使其对抗菌剂的抵抗能力大幅度提高，此外存在的各种循环通道有助于多种微生物的分布和代谢废物的排泄[2]。生物膜是由不同的PH浓度和代谢物构成的不同微环境，适合同一牙菌斑中多种微生物共同生长。在牙菌斑形成过程中，沉积于牙齿表面最初的一层生物膜称为“获得性膜”，其在牙齿表面暴露几秒钟后形成，紧接着是生物膜早期定植者的最初附着，其中链球菌和放线菌等革兰氏菌是主要定植体。存在定植体表面的“黏附素受体”与膜富含脯氨酸的蛋白结合，这种结合使被称为“隐窝”的受体位点暴露，从而进一步导致牙周病菌聚集。一层又一层的牙菌斑沉积造成环境缺氧，最终导致厌氧菌定植[3]。有氧与缺氧环境之间的主要桥接微生物定居者为梭杆菌类，而有氧条件菌逐渐转变为厌氧条件菌是牙龈炎向牙周炎进展的主要标志。

宿主对细菌性感染的反应是典型的先天性免疫反应，其主要表现为牙龈红肿、出血、肿胀以及中性粒细胞向炎症部位迁移。宿主先天性免疫反应既可以激活机体的主要宿主免疫细胞为机体抵御细菌感染做准备并触发适应性免疫应答，也可以诱导宿主细胞分化为特异性细胞，进而促进IL-1β等促炎性因子、前列腺素和TNF的级联激活，并通过激活特定的T淋巴细胞和B淋巴细胞参与机体的适应性免疫。相关研究发现，B细胞和T细胞参与激活核因子的受体激活因子的作用，促使破骨细胞激活并导致骨丢失，促进牙周炎的发展[4]。目前研究认为，牙周炎的大多数组织的损害是由于宿主对感染的应答反应而不是微生物的直接感染。

牙周炎是由多种危险因素共同作用所致，其中主要原因是口腔共生菌群的失调以及随后与宿主免疫系统的相互作用。牙周炎的严重程度取决于环境和宿主的危险因素，包括可改变因素（吸烟、咀嚼槟榔等）和不可变因素（遗传易感性等），最常见的有：年龄、慢性疾病、吸烟及口腔卫生保健习惯等。年龄增长及慢性疾病常引起人体内维生素、碳水化合物等缺乏或不平衡，从而引发牙周炎等一系列影响牙齿支撑结构（牙龈、骨和牙周膜）的炎症，这些炎症轻则导致牙齿的脱落，重则导致全身性炎症的发生[5]。常见慢性疾病中的危险因素是糖尿病，相关研究表明糖尿病患者的牙周炎发病率增加了86%[6]。吸烟是破坏性牙周炎的主要危险因素，牙槽骨丢失增加、牙周袋发育和牙齿丢失均与吸烟有关，吸烟人群的牙周组织的破坏性程度高且疾病风险程度随着吸烟时长的增加而增加，而戒烟则对患者的牙周健康具有显著的改善作用[7]。此外，牙周炎与口腔卫生保健水平密切相关，缺乏口腔健康知识、缺乏定期的口腔健康检测、不正确的刷牙方式等都会导致牙周炎，如果个体掌握牙周炎相关影响因素的知识，则能通过养成良好的生活习惯以及做好口腔卫生保健来降低患牙周炎的风险[8]。

二、牙周炎的口腔微生物群落的变化

口腔是食物和空气的主要入口，人体与环境之间有无数的微生物通过口腔进行交换。人类口腔中含有约60亿个细菌，种类约有种，不仅与龋齿、牙周炎和牙髓感染息息相关，而且在维持口腔健康方面发挥着重要作用[9]。从生态学角度看，口腔微生物以微生物群落的形式存在。口腔是一个生态系统，其稳定性和动态性对口腔健康有着深远的影响，口腔微生物群落每天都会受到频繁的生理和生化干扰，但它能在健康个体中保持长期稳定[10]。牙周菌群具有一定的复杂性和多样性，研究认为牙周炎患者和健康人的口腔微生物群落组成存在显著差异，并将放线菌群、牙龈卟啉单胞菌和连翘单宁杆菌确定为“牙周炎病原体”[11]。目前研究表明，正常口腔微生物群落的失调，在牙周炎的发生中起关键作用，而机体的炎症反应驱动了牙周微生物群的变化，并增强了牙周炎的发病[12]。研究显示，口腔微生物群中某些细菌和种群与各种牙周病之间存在一定特异性[13]。随着分子生物学以及测序技术的不断进步和发展，人们对口腔微生物的组成、复杂性和多样性进行了更为深入的研究。

以菌种培养为基础的口腔微生物研究方法虽然被认为是目前研究菌种鉴定最可靠的方法，但其存在一个很大的局限性，即检测效率低下。荧光定量PCR技术和下一代DNA测序（NGS）技术的发展和广泛应用，大大提高了检测效率，极大地促进了口腔微生物研究进程，发现了较多新的牙周炎致病菌。Parahitiyawa等[14]在口腔微珠瘤中应用了亚基因组检测技术，通过从龈下菌斑样本中扩增16srDNA检测到59种不同的物种，检测到的菌种数量是通过培养发现的菌种数量的两倍（28种）。Paster等[15]分析了个来自健康人和难治性牙周炎、成人牙周炎、HIV感染牙周炎和急性坏死性溃疡性牙龈炎患者的龈下菌斑样本克隆，在疾病患者中检测到部分特有的物种。Abusleme等[16]对22例慢性牙周炎患者的龈下微生物群落进行了分析，并通过与健康人的龈下微生物群落进行了比较，发现牙周炎样本中的细菌总数、物种丰富度和群落均匀度增加。Hong等[17]研究了未经处理的样本，发现持久性感染与原发性感染表现出相似的细菌群落多样性。Li等[18]对中国人侵袭性牙周炎患者口腔微生物群落进行的研究表明，患者及其家属中微生物群落的系统发育结构存在亲缘关系。综上所述可知，牙周炎患者口腔微生物菌群构成、菌群丰富度较健康人均发生着显著的变化。由此说明了口腔/牙周中菌种的变化是导致牙周炎的重要因素。通过检测，发现口腔微生物菌群的构成、丰富度及牙周致病菌的种类和数量的变化对研究牙周炎的发病机理具有重要的意义。

三、常用的牙周炎致病菌检测技术

随着分子微生物学和生物信息学的快速发展，微生物检测方法也由最初的普通培养鉴定技术发展为以基因特征为主的鉴定技术。牙周炎致病菌的鉴定方法和精确度也随着鉴定技术的发展得到大幅度地提高和完善。如今，牙周炎致病菌的检测方法主要有：细菌培养鉴定技术、荧光定量聚合酶链反应(qPCR)技术、新一代测序技术（16srRNA测序技术、全基因组测序、宏基因组测序技术）等。

1.细菌的培养和鉴定技术

细菌培养鉴定技术是微生物检测方法中最为传统的检测手段，一直以来是微生物检验鉴别的金标准。它是通过对微生物进行培养，观察不同微生物的形态结构和培养特性，从而达到区别和鉴定微生物的目的。如今，细菌培养鉴定技术仍是临床上检验鉴别微生物的主要手段，Siqueira等[19]通过细菌培养结合16srRNA测序技术对急性根尖脓肿进行微生物鉴定，发现急性根尖脓肿的微生物种类主要以厌氧菌为主且菌种类型主要集中在梭杆菌属、细小单胞菌属、普雷沃菌属、卟啉单胞菌属、二烯链球菌属、链球菌属和密螺旋体属，该结果为研究急性根尖脓肿的病因和治疗提供了有力的证据。此外，质谱分析也可被用来进行细菌鉴定，Geraci[20]通过将获得的源自单个菌落的分离细菌进行菌落培养，借助基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）对单个细菌物种的蛋白质谱进行分析。细菌培养鉴定法虽为金标准，但是仍存在工作量大且繁琐，培养费用高、耗时长等缺点，再加上厌氧菌的分离和培养要求过高以及培养方法存在很大局限性，很难对根尖脓肿微生物进行全面分析。同时，培养法依赖基于参考菌株的表型特征进行鉴定，因此其在鉴定过程中易受多种因素的影响导致鉴定困难甚至误判，有时成功培养也很难保证鉴定成功。以上是传统细菌培养方法存在的主要弊端和局限性，也是当今研究者善于将传统的培养法结合分子检测技术用于微生物检测鉴定的主要原因。

2.聚合酶链反应技术

聚合酶链反应技术（PCR）是一种传统的PCR技术，其依赖于DNA聚合酶，以遗传物质（DNA/RNA）作为模板，以寡核苷酸作为引物，在体外扩增特异性片段的技术。PCR技术在牙周炎致病菌的检测及基因型分析中得到广泛应用，它以方便、快捷、高敏感性、强特异性和低费用等特点，成为了牙周炎致病菌检测的一种技术手段。

传统的PCR技术除了以上的优点，也存在样本容易污染、假阳性高及无法定量等局限性。在传统PCR基础上发展起来的新型检测技术：荧光定量PCR技术（qPCR）很大程度上继承了传统PCR技术的优点，又弥补了传统PCR技术的不足。

qPCR技术在牙周炎致病菌检测中的应用，已经得到迅猛发展。qPCR在传统PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的变化实时监控PCR过程,不仅可以对初始模板进行定量分析，而且与应用于口腔病原菌的其他定量分析方法（流式细胞仪、DNA-DNA杂交等）相比，在敏感性、快速性和特异性方面具有明显的优势。Schmalz等[21]通过比较聚合酶链反应（PCR）和荧光定量PCR（qPCR）两种检测方法对5种牙周病潜在致病菌的检测效果，发现qPCR检测灵敏度较传统PCR检测技术好，但传统PCR技术也可以分析潜在的牙周致病菌种类。Soleimani等[22]运用qPCR技术检测份样品中五种口腔菌，测定放线菌聚集杆菌、中间普雷沃菌、连翘单宁菌、牙龈卟啉单胞菌和齿密螺旋体的含量，灵敏度均在96％-％之间且特异性高于90%。Jervoe-storm等[23]采用常规厌氧培养和qPCR对22例慢性牙周炎患者龈下菌斑样本中的5种病原菌（检测放线杆菌、核梭杆菌、牙龈卟啉单胞菌、中间普雷沃菌和连翘单宁杆菌）进行检测，结果发现，放线放线杆菌的灵敏度和特异度分别为67％和％，两种方法定量结果的Spearman相关系数分别为：放线放线杆菌0.82，齿龈假单胞菌0.83，这一结果说明这两种方法对于检测防线放线杆菌和牙龈卟啉单胞菌具有较高的一致性。在对比实验中，qPCR不仅与细菌培养技术具有很高的一致性，而且具有对细菌的鉴别能力高、检测灵敏迅速不产生交叉反应等优点。以上表明，qPCR技术在弥补传统PCR技术中无法准确定量和容易污染的不足时，更具备了快捷、敏感度高的优势，因此在牙周炎致病菌的检测中得到广大科研人员的认可。

对比传统的培养方法，传统PCR和qPCR等分子方法不仅具有更快捷、高灵敏度、高特异度的优点，而且大大简化了对临床样本检测的处理程序，极大降低了检测成本和繁琐的鉴定环节。

3.基于新一代测序技术的检测技术

测序技术推动科学研究的发展，科学界尤其是检验学越来越多的有用新一代测序技术来解决生物学问题。新一代测序技术（NGS）是一种高通量测序技术，在得到广泛应用之前，其常与微阵列技术结合被用于分析：(1)单核苷酸多态性（基因分型）；(2)mRNA转录本（转录分析）；(3)不同细菌菌株的全基因组（比较基因组分析）。但是，因为微阵列技术存在对差异表达基因检测或定量的不一致、非特异性交叉杂交和无法鉴定等位基因多态性等不足，所以逐渐被全基因组序列分析所取代。目前，对细菌生物的亚型分析和新物种的鉴定更依赖于核酸序列测序的方法。NGS技术具有低成本、快捷性、高通量等特点，使得基因分型检测越来越容易。NGS菌类鉴定技术可分为三大类：16srRNA靶向测序、全基因组序列分析和宏基因组学。

如今，原核生物最为广泛的分类学方法是基于16SrRNA基因序列的方法。基于高通量16SrRNANGS的技术可以帮助破译根管生物膜的复杂细菌群落,可用于研究不同牙髓病状况的微生物组[24]。Xiao等[25]通过16srRNA对糖尿病患者口腔微生物进行鉴定，结果发现，糖尿病患者口腔微生物组成发生改变，经验表明，糖尿病口腔微生物群更具致病性，16SrRNANGS提供了更深入的测序覆盖率，并检测到之前遗漏的低丰度病原体。Santos等[26]发现，与慢性感染相比，急性感染的细菌群落更为多样化，在检测到的个菌落中，约有18％在急性和慢性感染之间共享。在急性和慢性感染中，拟杆菌门最普遍。然而，与全基因组序列分析相比，许多具有相同或几乎相同16SrRNA基因序列的细菌生物在其基因组的其他区域具有很大差异，这表明16SrRNA基因序列在物种分型层面具有一定局限性[27]，由此出现了测量某菌的全部核酸信息的全基因组序列分析技术。

全基因组序列分析具有简易性、便捷性和低成本等特点，使其应用于广泛的致病菌研究，通过其对细菌种类的分析可以揭示物种的演变过程。全基因组序列分析和前述大多数基因分型测试的局限性是必须在培养的细菌样本上进行基因提取，才能确保DNA的纯度，而宏基因组学方法可以克服这种限制。

宏基因组也称为元基因组，指环境中全部微生物遗传物质的总和，它包含了可培养的和不可培养的所有微生物的基因。宏基因组测序技术的出现使得口腔微生物生态学、生物群落多样性及其变化和口腔微生物学的研究成为了可能。Wang等[28]通过宏基因组技术，比较分析了牙周健康和疾病相关的微生物群落的结构和代谢的变化，结果表明，菌落的结构与疾病状况具有很强相关性，并发现了大量新物种和新基因，丰富了牙周病口腔微生物的种类，为牙菌斑、口腔疾病的形成和演变奠定了基础。

结语

综上所述，随着科学技术水平的不断进步和发展，牙周炎病理分子机制的研究及检测手段不断深入和更新完善，从最初的显微镜检查、普通培养鉴定发展至核酸水平，使得人们对口腔/牙周微生物、遗传物质、毒力因子的研究达到了分子水平，并且在牙周致病菌的分类、致病机制及追踪病原体传播途径中也得到了许多研究进展。早期微生物技术主要以微生物的表型特征对菌种进行鉴定，而如今，将传统培养法结合分子检测技术是研究牙周炎致病菌种类和鉴定的主要手段。NGS测序技术的发展更为人们研究牙周炎致病菌种类和菌种进化对牙周炎的影响提供了方便、灵敏、快捷的检测手段，为人们进一步全面研究牙周病的病理机制奠定了重要基础。

参考文献

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[2]PlancakD,MusicL,PuharI.QuorumSensingofPeriodontalPathogens[J].ActaStomatolCroat,,49(3):-41.

[3]JenkinsonHF,LamontRJ.Oralmicrobial